里氏木霉的胞壁酰胺酶是其中的一种酶类，能够降解壳聚糖类物质，因此被称为纤维素分解真菌。

我们用配制添加剂的酶滤液在遗传毒性研究和亚慢性口服毒性研究中进行了测试。

旨在探究里氏木霉的胞壁酰胺酶作为家禽饲料添加剂对家禽的安全性和有效性。

数据和方法：

实验中我们要确保固体和液体形式确保保证最低活性为60，000LSU（F）13每克

该产品还含有内切-1，4-β-葡聚糖酶、内切-1，3（4）-β-葡聚糖酶和内切-1，4-β-木聚糖酶活性作为副活性。

分73批研究了固体制剂的批次间变异，平均值为600，70LSU（F）/g，范围为800，76至800，2LSU（F）/g（变异系数（CV）为8.<>%）。

该配方含有发酵提取物（18%），硫酸钠（70%），纤维素（6%），高岭土（4%），蔗糖（1%）和水（1%）。

该配方是一种细粒粉末，平均粒径为550μm，不含低于100μm的颗粒使用激光衍射进行测量，并且无尘（<0.010g粉尘/m3，用斯托伯-休巴赫检验测量）。

分五批研究了液体制剂的批次间变化，平均值为87，300LSU（F）/g，范围为80，000至95，000LSU（F）/g（CV为7.0%）

该配方含有发酵提取物（19%），山梨酸钾（0.05%），苯甲酸钠（0.15%），山梨糖醇（22%）和水（58.8%）

它是一种pH值范围为4.1至4.5的溶液，密度为1.1kg/L，在15°C时的粘度为25cP。

申请人对添加剂的微生物和化学污染设定的规格如下：总活菌数<5×104菌落形成单位（CFU）/g，大肠菌群<30CFU/g，25g添加剂中不含大肠杆菌和沙门氏菌属，砷<3mg/kg，镉<0.5mg/kg，铅<5mg/kg，汞<0.5mg/kg。

测试中间酶产物是否存在抗菌活性针对EFSA推荐的五种菌株、家禽粪便中常见的另外两种参考菌株和总共30种来自家禽来源的田间菌株。

在所有情况下，针对所有测试菌株的最低抑菌浓度（MIC）值等于或高于4mg/L。

下一个测试的稀释度为3毫克/升将是无效应浓度，这将是饲料中添加剂最大剂量的六倍。

考虑到胞壁酰胺酶催化细胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间糖苷键的水解，可以预期该添加剂对革兰氏阳性细菌特别是对革兰氏阳性细菌的作用。

在产品使用水平上测试的物种中没有看到这种效果。

稳定性和均匀性

在至少三个批次的样品中研究了固体和液体制剂的保质期，每种制剂在12、10、25或35°C的密闭容器中储存40个月。

24GT制剂在100°C、92°C、73°C时的初始酶活性回收率分别为56%、10%、25%和35%;液体制剂的相应值分别为40%、82%、68%和50%。

对于固体配方，研究了预混料和进料中的稳定性，包括热处理的效果。

将三批固体制剂以2，500LSU（F）/g预混料的剂量率混合到两种不同的鸡育肥维生素-矿物质预混合物中（一种含有氯化胆碱）

将样品储存在25°C的密闭容器中6个月，6个月后初始酶活性的恢复率为75%。25将三批固体制剂添加到以玉米和小麦为基础的鸡育肥完整饲料中（40，000LSU（F）/kg饲料），在80或90°C下沉淀。

在任一温度下，沉淀后的酶回收率约为80%，25将三批固体制剂添加到两种不同的鸡完全饲料中，用于育肥（40，000LSU（F）/kg饲料）。

以玉米和小麦为基础，进行80°C制粒25将醪液和颗粒饲料的样品在室温下储存在密闭容器中3个月。

与初始活性（颗粒饲料制粒后）相比，醪液储存3个月后的酶回收率接近86%，颗粒饲料的酶回收率接近92%。

分三批研究了液体制剂的稳定性，这些饲料喷洒到两种不同的完全和颗粒饲料上，用于鸡的育肥，基于玉米和小麦，预期剂量为每公斤饲料40，000LSU（F）。

将颗粒饲料的样品在室温下储存在密闭容器中3个月。储存3个月后的酶回收率接近94%，在稳定性研究中使用的饲料样品中研究了添加剂均匀分布的能力。

分析了所研究每种饲料的十个子样品，结果显示固体制剂的变异系数<11%，液体制剂的变异系数<6.5%。

目标物种的安全性

以18只同性鸡为一组，并被分配到四次饮食处理，基于玉米，小麦和豆粕的两种基础日粮发酵剂和种植者要么不补充，要么补充胞壁酰胺酶。

以提供每公斤饲料45，饮食以颗粒形式和随意提供，为期42天。

每天检查生病率，并对死去的动物进行尸检，在开始时和第21、35和42天对动物称重，在第21、35和42天测量采食量，并计算增重比。

在第35天，为了降低鸟类密度，在研究开始时选择的每个围栏两只鸟被移除，在移除之前和之后测量了围栏中鸟类的重量。

每周两次目视检查垃圾;湿度和结构以1-5分制评分，在研究的第25天，在排泄物中发现了血斑，并每天检查排泄物，直到研究结束。

在研究的最后一天，从每笔两只鸟身上收集血液样本，在研究开始时选择，并分析血液学28和生化29参数。

研究的最后一天，对每笔四只鸟进行了大体病理检查，在研究开始时选择，收集回肠样本进行显微镜检查。

最后，收集研究开始时选择的每栏两只鸟的盲肠内容物，并分析总需氧/厌氧微生物，梭菌，肠杆菌，大肠菌群，乳酸杆菌，沙门氏菌属和弯曲杆菌。

对考虑治疗和性别及其相互作用的数据进行了方差分析（ANOVA），在p<0.05时，效果被认为是显着的。

如果总体治疗效果显著，则使用最小显著差异（LSD）试验进一步考虑治疗之间的对比。

研究期间鸡的病亡率为1.7%，各处理间差异无差异，平均日采食量为104克/只，66组无差异。

对照组禽肉日均增重量分别为5.68、9.69、6.70和0.1g/只，分别为5×、10×和1×，增重比值分别为55.1、51.1、52.1和51.607。

与对照组相比，饲喂胞壁酰胺酶的组的日增重和增食比显著改善，除淀粉酶外，研究的血液学或生化参数没有发现差异。

对照组、695×、573×和664×组的淀粉酶结果分别为1、5、10和1U/L。

凋落物湿度和结构没有差异，但数据未进行统计分析，对尸检动物的宏观和显微镜检查结果显示，所检查的任何器官均未出现严重病变。

回肠组织的组织病理学评估未显示组间改变的差异。

对盲肠消化物微生物种群的研究表明，一般来说，添加剂没有影响。

与对照组相比，胞壁酰胺酶组的乳酸杆菌计数显示更高的值，这些结果表明，添加剂对所研究的胃肠道微生物种群没有影响。

这项鸡耐受试验的结果显示，当喂食10×最大推荐剂量时，对鸡的性能，血液参数和大体病理检查没有负面影响。

在三项试验中，使用1日龄的雄鸡进行育肥，并喂食非补充日粮或含有不同水平的壁酰胺酶的日粮，所有试验均包括每公斤饲料25，000LSU（F）的最低推荐剂量。

通过分析确认酶活性，饮食从生命的第1天到第35天随意进行，在整个研究过程中监测健康和死亡率，测量体重和采食量，计算增料比。

在之前的实验中，测量了干物质，粗蛋白，脂肪和灰分，钙和磷的回肠消化率。

这几次试验，记录了垫料的质量视觉和干物质含量，在研究结束时，评估鸟类是否存在足垫皮炎和胴体参数胴体重量，敷料百分比，乳房肌肉和腹部脂肪。

三项研究的结果表明，接受000LSU（F）/kg饲料的鸟类的饲料增重比有所改善，如果以每公斤饲料，000LSU（F）的浓度添加到饲料中。

这个添加剂有可能作为鸡育肥的畜牧业添加剂，同时这些结论可以外推到用于育肥的小型家禽种类。

结果显示评估的参数几乎没有差异，确定的那些通常很小（值在背景控制范围内），仅限于一种性别或与剂量无关，因此不被认为与治疗有关。

所以保留每公斤体重，616LSU（F）的剂量作为测试物质的无观察到的不利影响水平。